Aislamiento enzimático de protoplastos a partir de mesófilo de Dioscorea alata cultivar “Pico de Botella”

Abstract

Un protoplasto vegetal es una célula que carece de pared celular, se encuentra rodeada por su membrana plasmática y es potencialmente capaz de regenerar la pared celular, crecer y dividirse. El objetivo del trabajo fue evaluar diferentes concentraciones de enzimas comerciales y tiempos de acción en el aislamiento de protoplastos de Dioscorea alata cultivar “Pico de Botella”. Los protoplastos fueron aislados del mesófilo de vitroplantas combinando concentraciones de las enzimas Celulasa Onozuka R10® (0,0 a 1,5% p/v) y Macerozima R10® (0,0 a 0,5% p/v), a tiempos de acción de 6 a 18h y pH de 5,6; exponiendo aproximadamente 0,015g de hoja en medio de aislamiento de protoplastos de ñame a 27±2 °C, 40 rpm, seguido de lavado en medio de aislamiento sin enzimas, purificación en sacarosa al 24%, resuspensión en medio de cultivo de protoplastos de ñame y conteo en cámara de Neubauer. La mayor cantidad de protoplastos se obtuvo con Celulasa al 1% y Macerozima al 0,5% en 18h de acción, con un promedio de 18,6 x106 protoplastos g-1 de tejido fresco. Los análisis de regresión (R2 = 0,84) de los datos obtenidos arrojaron, que las condiciones óptimas para obtener la mayor cantidad de protoplastos aislados corresponden a una combinación de 0,96% de Celulasa y 0,36% de Macerozima, a 13,99 h de acción, estimando un valor de 15,3x106 protoplastos g-1 de tejido. El método enzimático permite aislar protoplastos de ñame, recomendándose evaluar su viabilidad para regeneración su pared celular, crecer, dividirse y formar microcolonias y microcallos